1499年12月文艺复兴时期，40岁的艾吉奥放弃刺杀教皇亚历山大六世罗德里格·波齐亚(圣殿骑士团大团长)后回到蒙特里久尼。

1500年1月，教宗之子西泽尔·波奇亚一天晚上领兵对城市发动攻击。西泽尔于城破之时夺回艾齐奥伯父马里奥·奥迪托雷保管的古代遗物"伊甸园碎片-金苹果"、将之枪杀并命士兵枪伤艾齐奥。

艾齐奥负伤带领佣兵及家人逃走后独自前往意大利首都罗马，并发现波奇亚家族已几乎完全控制了整个罗马市，市区百业萧条，市民被剥削而生活困苦。

以市内台伯河上的小岛台伯岛为基地，艾齐奥联结市内妓女、盗贼及佣兵势力，以及招揽反抗的市民加入其刺客兄弟会以解放在教宗势力控制下的罗马。

于各方协助下，艾齐奥得知西泽尔的财政由其兄长胡安·波奇亚负责，而西泽尔则欲借助法国瓦卢瓦公爵路易十二的军事力量以及发明家达芬奇之战争机器以征服意大利。

支线任务大概分三大类：

妓女任务：妓女从一些来“光顾”她们的罗马高官那里取得情报，然后就告诉主角Ezio，让主角去刺杀某些红衣教士或者官员的任务。

盗贼任务：与刺客信条2不同，兄弟会里面活跃于罗马的盗贼集团有两个，一个是主角可以雇佣的普通小偷，另一个就是与主角作对的，中文翻译“百眼帮”的盗贼集团，所以盗贼支线任务大部分都是和百眼帮干架、暗杀百眼帮、抹杀与百眼帮有关系的人为主的。

佣兵任务：由于兄弟会里面的佣兵长和主角一样都是刺客同门，所以佣兵任务有部分是抹杀圣殿骑士特务，有部分是帮助佣兵长抗击法国军队，和主线有一定关联，都是为了推翻头号Boss西泽尔。